2023年全国硕士研究生考试考研英语一试题真题(含答案详解+作文范文)_第1页
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文档简介

1、DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNADependentProteinKinaseCatalyticSubunit),与另外两个亚单位Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物。与ATM、ATR等同属于磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3kinase-relatedproteinkinase,PIKK)超家族成员。最初确定的DNA-PKcs的功能是参与DNA双链断裂的非同源末端

2、连接(NHEJ)和V(D)J重组,后来又发现其在维持染色体端粒末端结构稳定性中发挥重要的作用。研究显示DNA-PKcs以其丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶活性可磷酸化多种重要的功能蛋白底物,包括有多种癌基因产物和转录因子,如c-fos、c-myc、oct-1、c-jun等,表明DNA-PKcs是一种具有多种功能的蛋白。 近年来有越来越多的实验研究报道,DNA-PKcs在肿瘤组织中异常高表达。如Hosoi等发现在多种类型肿瘤组织中DNA-P

3、Kcs的mRNA和蛋白水平以及激酶活性均高于正常组织,Um等发现在侵袭转移能力强的肿瘤组织中DNA-PKcs的蛋白表达和激酶活性高于侵袭转移能力低的肿瘤细胞,由此推测DNA-PKcs与肿瘤转移相关联。此外,某些组织来源细胞的不同发育阶段DNA-PKcs的表达水平也不同,生殖细胞减数分裂前DNA-PKcs表达明显高于减数分裂后,而一些没有增殖能力的细胞根本不表达DNA-PKcs或DNA-PKcs表达水平非常微弱。本实验室的前期研究发现,在

4、辐射诱发的部分癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性均显著提高;通过免疫组化分析显示约90%的肝癌患者的癌组织中DNA-PKcs表达呈强阳性,而对照的正常肝组织中所检测到的DNA-PKcs水平明显要低;发现肺癌组织中DNA-PKcs的蛋白水平和激酶活性也明显高于癌旁组织。本论文在前期研究结果的启示下,对DNA-PKcs的功能以及作为抗癌靶分子的可行性进行深入研究,取得了如下主要进展: (1)利用DNA-PKcs抑制剂三氟拉嗪(

5、TFP)和γ射线分别处理HeLa细胞,结果显示TFP对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用,并诱发细胞凋亡,随着药物剂量的增大和用药时间的延长,细胞生长速度减慢,凋亡率增加,而且TFP可增加细胞对辐射的敏感性。进一步分析其分子机制发现,TFP或γ射线作用HeLa细胞后,都可诱导DNA-PKcs的降解,而且TFP可增加射线导致细胞内DNA-PKcs的切割降解程度,从而促进细胞凋亡的发生,增强细胞对辐射的敏感性。另外,MAPK激酶p38激活被

6、认为在HeLa细胞中起对抗凋亡的作用,抑制p38活化可有效促进细胞凋亡的发生,实验结果表明TFP可抑制γ射线诱导的p38磷酸化,从而促进细胞凋亡。 (2)为了进一步研究DNA-PKcs在肿瘤发生和恶性转化中的作用,我们利用更为特异的RNA干扰技术(siRNA)成功的使DNA-PKcs蛋白表达下降,获得了DNA-PKcs表达沉默的稳定细胞模型。结果表明细胞对γ射线及紫外线的敏感性增加,DNA-PKcs表达沉默细胞的生长速度和接种裸

7、鼠后形成肿瘤的生长速度减慢。这些结果表明DNA-PKcs除通过其DNA修复功能影响细胞的辐射敏感性外,还可能与肿瘤细胞增殖有关。 (3)利用基因芯片技术对DNA-PKcs表达沉默细胞以及对照细胞进行了细胞信号转导相关基因的mRNA表达水平比较,发现15个与细胞信号转导有关的基因在DNA-PKcs表达沉默细胞中表达升高,其中一半是与干扰素信号转导反应有关的基因。8个基因表达下降,包括有细胞增殖和侵袭转移相关基因等。RT-PCR半定

8、量分析结果与芯片结果相一致。又利用SEAP报告质粒系统进行检测,进一步证实其中的NFAT转录活性下降。以上结果提示DNA-PKcs具有直接或间接调控细胞信号转导相关基因的表达,而且大多与细胞增殖分化有关。值得注意的是,其中部分是c-myc的靶基因如P21、P27、NDRG-1。 (4)鉴于DNA-PKcs影响表达的部分基因是c-myc蛋白的靶基因,利用DNA-PKcs沉默表达细胞模型,进一步探讨了DNA-PKcs新的生化功能。利

9、用Westernblot检测原癌基因c-myc的表达变化,结果发现DNA-PKcs表达抑制后,c-myc蛋白表达水平明显下降,细胞中c-myc蛋白对靶基因转录的激活作用也随之降低。DNA-PKcs抑制剂Wortmannin同样可抑制c-myc的蛋白表达和活性。但是在上述条件下c-myc的mRNA表达水平几乎无任何变化,表明DNA-PKcs是在蛋白水平调节c-myc表达。进一步的免疫共沉淀实验结果表明,DNA-PKcs与c-myc蛋白存在

10、相互结合作用。以上表明DNA-PKcs具有维持c-myc蛋白稳定性的功能,DNA-PKcs有可能通过此信号通路在一定程度上参与细胞的恶性转化。 (5)DNA-PKcs如何调控c-myc蛋白稳定性是本研究进一步关注的焦点,根据最新的文献资料和本研究的实验结果,我们提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信号通路,为此又做了进一步分析验证。用泛素化蛋白酶体的抑制剂(MGl32)及GSK3抑制剂氯化锂(LiCl)分别处理

11、细胞,结果表明MGl32和LiCl处理后能逆转DNA-PKcs表达沉默后细胞中c-myc蛋白水平的下降,这样为确认DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc信号通路提供了关键性实验依据。 (6)本实验室的前期研究发现DNA-PKcs可与CyclinT2相互结合,而CyclinT2参与基因转录调节过程,因此我们推测也许DNA-PKcs在转录偶联修复(TCR)中起着一定的作用。为了验证DNA-PKcs的TCR功能,首先建立了一种

12、基于DNA链特异性PCR方法检测DNA转录偶联修复的新技术,利用此技术研究发现,对照细胞NC中DHFR基因转录链的修复要明显快于非转录链以及DNA-PKcs表达沉默细胞的基因转录链,而两组细胞的泛基因组修复水平无明显差异,首次表明DNA-PKcs参与DNA转录偶联修复反应。 本课题研究首次发现了DNA-PKcs对c-myc蛋白稳定性的影响,并提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信号调节通路,为阐述DNA-PKc

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