金黄色葡萄球菌(ATCC6538)蛋白A基因的克隆及应用研究.pdf

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    编号:20190224120232392    类型:共享资源    大小:3.75MB    格式:PDF    上传时间:2024-01-05
      
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    抗体药物和制剂因为其特有的免疫学活性和目标针对性,近年来成为发展最快的一类生物技术药物,销售额也在最近短短十年的时间里从3.1亿美元上升到258亿美元。在整个生物制药行业中占的比例也从1/5上升到1/3。抗体的生产不仅为现代生命科学研究提供了重要的工具,而且在基因、蛋白质的结构和功能研究方面发挥着重要的作用。而作为在抗体药物和制剂生产中不可缺少的重要环节-抗体纯化,则从某种有意义上决定了抗体药物生产质量和水平。而在抗体纯化技术中亲和层析技术的发展显得尤为重要,目前商业化的亲和层析产品昂贵的价格也提高了抗体药物和制品的成本。
       金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)是上世纪70年代发现的能与多物种抗体Fc端进行结合的菌体蛋白,自发现以来就一直作为重要的抗体纯化层析配体进行研究,目前也是商业化较完善、应用较为广泛的亲和配体。所以能否提高SPA的活性和稳定性,对于抗体药物的生产显得尤为重要。
       本实验首次以ATCC6538株金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆得到了SPA的全长基因1503bp,编码501个氨基酸。经过与标准菌株CowanI的SPA比对,其中成熟蛋白功能区氨基酸序列(1-289)是完全相同的,具有5个IgG结合域,而X区域(305-370)有所不同,所以将这株菌的SPA序列发布到GenBank上供其他研究者参考,检索号为EU695225。
       本实验同时构建了两种高效表达载体pHis-SUMO-SPA(全长蛋白)和pHis-SUMO-FSPA(功能区蛋白),转化入宿主菌Rosetta,将SPA的全长蛋白和功能区片段与SUMO标签进行融合表达,利用SUMO标签的作用提高SPA蛋白的稳定性和活性,经过IPTG诱导和表达条件的摸索,利用AKTA蛋白纯化系统纯化得到了纯度较高的SUMO-SPA和SUMO-FSPA蛋白。
       在利用ELISA方法对SUMO-FSPA的抗体结合活性和稳定性进行检测实验中,SUMO-FSPA显示出较好的抗体亲和性和稳定性,并将SUMO-FSPA于活化的琼脂糖连接,连接产物SUMO-FSPA-agarose成功应用于抗体的纯化。这些结果都说明利用SUMO标签与SPA的融合表达可以提高SPA蛋白的稳定性,没有影响与抗体的结合能力,并可以作为模型深入的开发抗体纯化产品。
      
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    本文标题:金黄色葡萄球菌(ATCC6538)蛋白A基因的克隆及应用研究.pdf
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