双水相萃取尿酸酶和磷酸甘油氧化酶.pdf

1、双水相萃取技术是一种利用物质在两相间选择性分配的分离纯化技术，其原理与水一有机相萃取原理相似。双水相体系是指高聚物之间或高聚物与无机盐之间以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相体系。该体系含水量高，蛋白在其中不易变形；表面张力低，有助于强化相间的质量传递；分相时间短，易于放大和连续操作，萃取环境温和，生物相容性好等，考虑到双水相萃取技术的以上诸多优势，因此本文就采用了双水相萃取技术分离纯化尿酸酶和磷酸甘油氧化酶，建立了适当的双水相体

2、系，并对影响萃取效果的各种因素进行了研究。同时对萃取后，酶的进一步分离纯化和鉴定作了相关研究。主要研究结果如下： 1.选用PEG和硫酸铵作为双水相体系的组成部分，分别用三种分子量的PEG(即PEG400，PEG600，PEG2Q00)与硫酸铵建立起三种双水相体系。并确定了组成浓度的范围。 2.利用三种双水相体系萃取分离发酵后的菌体破碎液中的尿酸酶，确定了萃取尿酸酶的最佳PEG分子量为2000。研究了萃取体系中各种因素对尿

3、酸酶萃取的影响，确立了萃取尿酸的最佳条件。当PEG2000为25％，硫酸铵为9％，PH=7.5，NaC12％为，粗酶量为5％时，萃取后的尿酸酶的纯化倍数达到了10，回收率约为90％。根据SDS-PAGE检测，得出萃取后的杂蛋白明显少于萃取前。并采用DEAE阴离子交换层析对双水相萃取后的尿酸酶进一步纯化，通过SDS-PAGE进行鉴定，还原和非还原均得到一条带。 3.利用双水相体系萃取发酵中的磷酸甘油氧化酶，确定萃取GPO的最佳PE