S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的构建及活性分析.pdf

1、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核细胞中具有重要的甲基循环代谢调节作用，是存在于生物细胞内调节甲基反应的一种水解酶，此水解酶广泛存在于真核细胞如：人类、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反应。研究表明人体内 S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影响冠心病和阿尔茨海默症即老年痴呆病的发病概率。
　　为了更好的研究该酶，我们通过基因克隆技术将

2、人源表达SAHH的基因整合到毕赤酵母菌基因组上，成功构建真核表达体系，再利用毕赤酵母菌表达该目的蛋白SAHH。具体的实验方案如下：首先，我们从 GenBank中查找到编码人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，在此目的基因前后设计酶切位点和重组标签 His-tag。通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，构建pPIC9K-sahh表达载体。然后，利用同尾酶 Bgl II酶切克隆载体，通过电转化使其整合到毕赤酵母

3、菌 GS115的基因组中，用遗传霉素 G418筛选出高拷贝转化子，转化子通过 MD和 MM平板鉴定其表型为 MutS型。经菌体 PCR验证后，将筛选到的阳性转化子用1％甲醇诱导，使其分泌 SAHH蛋白，之后我们利用冷冻干燥器将产物浓缩，利用0.22μm的滤膜过滤杂质和晶体。最后，我们将浓缩后的液体通过 Ni-NTA亲和层析对重组 SAHH蛋白进行纯化。此方法具有筛选方便、蛋白产物分泌表达稳定和易于纯化等优点。人源 sahh基因包含129

4、9个碱基对，其编码432个氨基酸，因此理论上此水解酶的相对分子量约为47.5 kDa，通过 SDS-PAGE得出发酵产物的条带大小约为48 kDa。由于SAH被 SAHH一步水解为高半胱氨酸和腺苷，而高半胱氨酸可直接用 Ellman试剂直接定量测定，在412 nm下吸光度随着产物的升高而升高，我们测得浓缩后的 SAHH蛋白酶活为626.6 IU，而经过 Ni-NTA亲和层析纯化后的 SAHH蛋白酶活为1106.8 IU。而对照组即 sa

5、hh基因没有整合到毕赤酵母菌 GS115基因组上的菌体通过此方法发酵得到的产物，测其酶活性约为1.33 IU，因此对于毕赤酵母菌 GS115本身的发酵产物对本实验的研究结果可以忽略不计。同时我们通过查阅文献获知有些研究通过对表达体系的表达条件进行优化后酶活可达到1600 IU相比我们所得的酶活较高，但是我相信我们在之后的对表达体系的表达条件进行优化后一定比1600 IU高。
　　结论：此研究中我们成功构建毕赤酵母菌真核表达体系，同