蛋白酶体激活因子REGγ与泛素连接酶Smurf1相互作用的初步研究.pdf

蛋白酶体系统是生物体内一类受多种复杂因素调控的蛋白质降解系统，在机体蛋白质的降解调控过程中具有重要的作用。目前研究揭示蛋白酶体主要由20S中央核心催化腔和两侧的调节亚基组成。其中，20S中央核心催化腔呈圆筒状结构，由外侧的两个α螺旋环和内侧的两个β螺旋环构成，每个环由七个亚基构成，α环形成狭窄的轴向门控通道，β环形成含有多种蛋白水解酶活性位点的降解腔。蛋白酶体两侧的调节亚基主要有两类：一类是19S蛋白酶体激活因子，主要参与机体内能量和泛素依赖的蛋白酶体降解过程；另一类是REG蛋白酶体激活因子家族，主要包括REGα、REGβ和REGγ三个成员，主要参与机体内能量和泛素不依赖的蛋白质降解途径，主要对细胞免疫反应，机体内重要的细胞周期、细胞凋亡、细胞生长和细胞分化等进行调控。其中，REGγ最早发现于系统性红斑狼疮病人的血清，被命名为Ki抗原，进一步研究揭示REGγ在脊椎动物和非脊椎动物中均高度保守，是一类高度保守的细胞核蛋白，主要存在于高等动物、昆虫和蠕虫细胞核中，而在酵母和植物细胞中未见相关报道。目前的研究发现REGγ主要以泛素和能量非依赖的方式降解其底物蛋白p21、p16、p19和SRC3等，进而调控细胞周期、细胞凋亡和肿瘤发生等重要生命过程。　　泛素蛋白酶体系统（UbiquitinProteasomeSystem，UPS）是真核生物体中具有高度选择性的蛋白质降解系统，由泛素（Ubiquitin）、泛素活化酶（Ubiquitinactivatingenzyme，E1）、泛素结合酶（Ubiquitinconjugatingenzyme，E2）、泛素蛋白连接酶（Ubiquitinproteinligase，E3）、26S蛋白酶体和泛素解离酶（Deubiquitinatingenzymes，DUBs）等组件组成。其中，E3s是泛素蛋白酶体系统主要组成部分，决定了该系统与底物蛋白结合的特异性。按其结构特点可分为RING（Reallyinterestingnewgene）锌指结构和HECT（HomologoustoE6APCterminus）结构域两大类。Smad泛素化调节因子1(Smadubiquitylationregulatyfact1，Smurf1)就属于HECT类E3NEDD4家族主要成员之一，主要介导成骨细胞中BMP信号通路中蛋白分子的降解。本实验室通过长期的研究揭示CKIP1（CaseinKinase2InteractingProtein1）可特异性地靶向结合Smurf1两个WW结构域之间的连接区，增强Smurf1与底物Smad15的亲和力，促进底物蛋白泛素化降解。进一步地，我们以Smurf1的WW结构域及其连接区和CKIP1蛋白全长为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选成人脑文库钓取相互作用蛋白，其中一个猎物分子为REGγ。在我们实验室开展的大规模酵母双杂交杂交筛选得到的大量相互作用中，其它诱饵并未钓取到REGγ，提示Smurf1与REGγ的相互作用不是非特异结合。过表达实验结果显示Smurf1对外源的REGγ蛋白水平没有显著影响，REGγ对外源CKIP1蛋白水平也没有显著影响；然而惊奇地发现，过表达REGγ可以促进外源Smurf1蛋白的降解，因此开展了Smurf1与REGγ相互作用的研究，数据表明，Smurf1与REGγ的确存在相互作用。同时过表达REGγ也促进Smurf1突变体C699A蛋白降解，该位点突变使得Smurf1丧失自身结合泛素的能力，提示REGγ对Smurf1的调控不依赖Smurf1介导的自身泛素化修饰。RNA干扰实验敲低内源REGγ蛋白水平，导致内源Smurf1蛋白水平上升。在MCF7细胞中过表达的REGγ与Smurf1部分共定位于细胞质。体外蛋白酶体水解实验证实在不提供能量和泛素时，REGγ能够促进20S蛋白酶体对Smurf1的降解，说明REGγ调控Smurf1的降解是一个能量和泛素非依赖的过程。综上，我们第一次揭示了蛋白酶体激活因子REGγ与泛素连接酶Smurf1之间的相互作用及其生化功能，为了解Smurf1的降解机制及REGγ的生物学功能提供了科学依据。