硫化氢激活EcDOS及其化学修饰血红素机制研究.pdf

1、大肠杆菌氧感应蛋白(Direct Oxygen Sensor from E.coli,EcDOS)是大肠杆菌c-di-GMP细胞信号通路中的重要调控蛋白。其c-di-dGMP催化活性使其具有代谢信号分子的功能。研究发现该蛋白的催化活性能被氧气激活,后又有发现证实气体信号分子NO,CO同样具有激活其酶活性的作用。最近的研究已检测到另一新的气体信号分子,H2S也具有激活EcDOS活性的作用,但其仅对Fe3+血红素的EcDOS有作用,而NO和

2、CO仅作用于Fe2+血红素的EcDOS。而且,H2S对EcDOS的激活具有氧依赖性,即无氧环境下H2S的激活作用远小于有氧环境。这暗示着,H2S与EcDOS血红素的反应机理同NO或CO并不相同,或许更为复杂。
　　本文将详述综合运用光谱学和质谱学分析手段探究H2S作用机理的全部细节。本研究利用定点突变技术将EcDOS血红素结合域(调控结构域)—EcDOS-PAS上两个最重要的血红素互作位点M95、R97进行突变。利用光谱学比较突变

3、后的蛋白其与H2S的反应有何不同?光谱学结果证实这两个位点都是蛋白质中与H2S相互作用的位点,而R97则是更为重要的直接作用位点。R97的突变导致蛋白与H2S的反应能力丧失,且蛋白结构稳定性受到影响。具体表现为,R97位点突变导致血红素结合部位空间构象改变(预测),导致H2S与EcDOS反应过程中,产生大量活性氧(H2O2为主,实验证实)。过氧化氢的产生使得血红素极易被氧化,从而进一步产生血红素的共价修饰,生成verdoheme。这一发

4、现对于理解蛋白-血红素相互作用提供了新的参考。
　　综上,本文的主体部分将展示以下几点发现的全部方法和证据及论证过程:
　　(1)采用镍亲和层析柱(GE Histrap-HP)可一步纯化制备Ec DOS野生型及其突变蛋白,牛血清来源的凝血酶(Sigma)可准确切割6-组氨酸标签,为EcDOS的相关研究提供合格的蛋白样品。
　　(2)Met95和Arg97都是EcDOS与血红素上结合的配体相互作用的关键位点,其改变使得H

5、2S与血红素的结合受到不同程度的影响。R97是更为重要的直接作用位点,突变这一位点会完全改变H2S与血红素的结合以及产生新的反应。
　　(3)R97A和R97I这两个突变型表现出不同于野生型和其他突变蛋白的反应特性,这样的突变可能导致蛋白构象的显著改变。
　　(4)血红素加氧酶代谢血红素的第一步产物加氧血红素和副产物一氧化碳在R97A和R97I这两个突变蛋白与H2S的反应中被检测到。中间产物过氧化氢也被证实在反应过程中产生。