水通道蛋白的结构与功能研究.pdf

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是广泛存在于原核和真核细胞膜上特异性快速转运水分子的孔道。在哺乳动物体内已发现的水通道蛋白有13个成员，分别命名为AQP1-AQP12。水通道蛋白在机体内选择性地表达于多种组织和器官，并且发挥重要的生理功能。人们对水通道蛋白结构与功能的研究近些年已经广泛地开展，所使用研究方法与手段也比较丰富。其中利用基因打靶动物模型进行研究是一种重要的手段，此方法的结果直观、相对可靠，而且反映基因在动物体中的作用。本论文就是应用或者建立水通道蛋白基因打靶小鼠模型，来研究水通道蛋白的结构与功能。
　　本论文的内容分为两章。在第一章的工作里，通过对AQP8基因敲除小鼠模型的研究，发现了AQP8在雌性生殖系统的新功能并且阐明了相关的机理。首先在繁殖小鼠的时候发现雌性AQP8基因敲除鼠的生育力显著强于野生型小鼠（分别为每胎产仔数8.4±1.5个和6.7±2.1个）。继续分析这一表型发现原因是AQP8敲除鼠卵巢的排卵数显著多于野生型。对卵巢进行组织学检测显示AQP8敲除鼠的黄体数目显著多于野生型。然后通过RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学等分子生物学手段确定AQP8表达于卵泡颗粒细胞上。颗粒细胞上AQP8的缺失导致排卵增多的表型的机理是需要深入探讨的。作为水通道蛋白，AQP8的缺失对颗粒细胞水转运功能的影响得到检测，结果表明AQP8敲除鼠颗粒细胞的水通透性比野生型降低了45％。因为卵巢中卵泡的闭锁很大程度上缘于颗粒细胞的凋亡，所以本研究检测了AQP8敲除鼠颗粒细胞的凋亡率，结果显示这一数据显著低于野生型颗粒细胞（分别是21.3±3.6％和32.6±4.3％）。因此推测可能的机理为:因为卵巢中发育的绝大多数卵泡都要闭锁退化，只有极少数卵泡可以发育成熟并排卵，在AQP8基因敲除鼠中，因颗粒细胞的凋亡率降低，导致闭锁的卵泡减少，使发育成熟的卵泡增多，排卵增加，生育力增加。同时在AQP8敲除鼠中发现增多的多卵卵泡，提示AQP8参与卵泡的形成。本研究首次发现AQP8影响雌性排卵的表型和机制，这将为妇产医学提供新的视点，即通过影响水通道蛋白的表达而进行雌性生育控制。
　　本论文内容的第二章是建立AQP4-A25Q突变基因敲入小鼠模型。AQP4是中枢神经系统中表达的重要水通道蛋白，不仅在大脑水代谢中发挥重要作用，而且参与调控神经传导，并且是视神经脊髓炎的自身抗原。AQP4有一个显著特点是在细胞膜上形成正交列阵结构（orthogonal arrays of particles，OAPs），而这一结构的生理和病理功能尚不清楚。据报道，AQP4的氨基酸突变 A25Q能解聚AQP4的正交列阵结构，故本研究拟建立 AQP4-A25Q基因敲入小鼠模型，目的是利用该动物模型研究AQP4正交列阵结构在体内的功能。首先本研究构建了插入型基因打靶载体，经过胚胎干细胞转染、筛选等步骤得到了重组克隆，然后经胚胎显微操作、动物传代和Cre-LoxP系统剪切得到了纯合体AQP4-A25Q基因打靶小鼠模型。经基因型分析、RT-PCR、DNA测序和免疫组织化学等鉴定，从基因组水平、mRNA水平、蛋白质水平等多方面证实该模型建立成功。后续工作计划首先检测AQP4正交列阵结构的解聚，然后应用多种生理学手段研究AQP4正交列阵结构的功能。此AQP4-A25Q突变基因敲入小鼠的建立为AQP4正交列阵结构的功能研究提供了有效的动物模型。