胃癌细胞SGC-7901中β3Gn-T8与转录因子c-Jun相关性初探.pdf

1、目的:β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(β3GnTs)家族是糖基转移酶的重要成员。其中β1，3葡萄糖基转移酶8(β3Gn-T8)，又名β1，3半乳糖基转移酶7(β3GalT7)，是本课题组首先在国际上克隆获得的人类糖基转移酶新基因。本论文通过生物信息学方法分析了β3Gn-T8上游调控序列启动子区，发现β3Gn-T8启动子区有多个c-Jun结合位点。为了进一步阐明β3GnT8与c-jun的相关性，本研究以c-jun中等表达和β3Gn-T

2、8高表达的人胃癌SGC-7901细胞株为研究对象，探讨胃癌SGC-7901细胞株中转录因子c-Jun对糖基转移酶β3Gn-T8的转录调控。
　　 方法:
　　 1、应用三种生物信息学软件对β3Gn-T8启动子区的转录因子c-Jun的结合位点进行预测，并构建c-Jun基因的正义表达载体，经酶切、测序鉴定重组质粒。
　　 2、根据预测结果构建β3Gn-T8启动子区系列截短体，应用双荧光素酶报告基因技术分析β3Gn-T

3、8启动子区系列截短体的转录激活活性。
　　 3、设计并构建4条针对c-Jun mRNA靶点的siRNA真核表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同时设计shRNA无关序列作为阴性对照(negativecontrol，NC)，并构建表达载体;以脂质体法转染胃癌SGC-7901细胞，荧光显微镜观察以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则，优化转染条件，根据优化的条件将pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒转染胃癌SGC

4、-7901细胞，应用RT-PCR和Western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测四组pGPU6/GFP/Neo-shRNA对c-Jun基因表达的抑制作用，筛选出干扰效果最好的一组表达载体用于后续实验。
　　 结果:
　　 1、生物信息学分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三种在线软件预测结果分析β3Gn-T8启动子区存在着c-Jun基因的多个结合位点。
　　 2、双荧光素酶报告基因结果显示

5、:c-Jun对β3Gn-T8启动子区具有转录激活作用，其中启动子区—561/+8片段的转录活性最高，且对c-Jun呈剂量依赖性。
　　 3.pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组质粒表达载体构建:靶向c-Jun mRNA的四个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组质粒表达载体经酶切、测序鉴定，证实载体构建成功;重组质粒表达载体通过脂质体介导转染人胃癌SGC-7901细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光，RT-PCR和Wes

6、tern blot结果证实pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949对c-Jun表达抑制的效果最好。
　　 结论:
　　 1、生物信息学软件预测结果显示β3Gn-T8启动子区存在着转录因子c-Jun的多个结合位点。
　　 2、双荧光素酶报告基因结果显示c-Jun对β3Gn-T8启动子区具有转录激活作用，启动子区—561/+8片段的转录活性最高，且对c-Jun呈剂量依赖性。
　　 3.针对c-Jun基