一株海洋来源链格孢聚酮合酶及真菌非还原型聚酮合酶PT结构域系统研究.pdf

1、真菌能够产生结构和功能复杂多样的聚酮化合物，由巨大的、多结构域的聚酮合酶合成。大部分真菌聚酮合酶属于多结构域单一模块化的Ⅰ型聚酮合酶，依据功能和系统发育关系可分为非还原型(NR-PKS)，部分还原型(PR-PKS)和高度还原型(HR-PKS)，其催化β酮的还原程度、结构域组成以及代谢化合物类型不同。其中，非还原型聚酮合酶催化非还原聚β酮链发生环化反应，形成单环或多环的芳香聚酮化合物。最近研究表明，真菌非还原型聚酮合酶家族中特有的PT结构

2、域，控制聚酮化合物主链环化反应的区域选择性，并决定了产物的最终结构。当前，应用组合生物合成方法研究聚酮化合物生合成途径，通过操作聚酮合酶提高化合物产量或获得新化合物及高活性化合物，是化学生物学研究的热点。本实验室前期分离出一株肉芝软珊瑚来源的共附生真菌链格孢Alternariaalternata M311B，其代谢产物结构多样，大多为聚酮化合物，其中的蒽醌类、苯醌类化合物显示很强的化学生态作用和药理活性。本研究运用分子生物学方法获得M3

3、11B聚酮合酶序列，在运用生物信息学方法系统分析真菌聚酮合酶序列、结构与功能基础上，预测M311B聚酮合酶结构域的结构、功能位点以及序列与产物的关系，以期为M311B聚酮合酶的组合生物合成研究提供基础资料。
　　M311B聚酮合酶序列的获得
　　通过简并引物的方法，克隆得到8条M311B聚酮合酶序列。根据系统发育关系，将8条M311B聚酮合酶序列分类，其中M311B聚酮合酶PksA和PksI分类为真菌非还原型聚酮合酶，为首次

4、在链格孢中分类得出非还原型聚酮合酶。推测M311B聚酮合酶PksA和PksI与M311B苯醌类、蒽醌类化合物的合成相关，M311B高度还原型聚酮合酶PksJ参与M311B分离的化合物中格链孢酚和4-甲氧基格链孢酚的生合成。
　　真菌非还原型聚酮合酶PT结构域序列、结构与功能生物信息学系统分析
　　由于M311B苯醌类、蒽醌类化合物的生合成应与非还原型聚酮合酶相关，而PT结构域作为非还原型聚酮合酶的重要功能域，控制了聚酮化合物

5、主链环化反应的区域选择性，决定了产物的最终结构，分析PT结构域，将对从M311B聚酮合酶序列预测化合物结构类型，以及通过生合成修饰改造聚酮化合物结构都具有重要作用。从而，本研究基于大数据挖掘，对真菌非还原型聚酮合酶，尤其对其PT结构域进行了序列、结构、功能的系统分析。
　　分析当前数据库中所有的共计661条真菌非还原型聚酮合酶的PT结构域，探讨其序列、结构、功能之间的联系。基于系统发育和结构域组成分析，所有661条非还原型聚酮合酶

6、可被分为主要的8种亚型（亚型Ⅰ-Ⅷ），其中亚型Ⅷ为首次发现。PT结构域的系统发育关系与非还原型聚酮合酶全长氨基酸序列基本一致，分别将亚型Ⅰ-Ⅷ的PT结构域与环化方式（C2-C7，C4-C9，C6-C11）和合成的化合物相联系。使用三种比较蛋白质模建方法，分别模建各亚型PT结构域的三维结构，并在原子水平对模建的三维结构进行动力学优化。质量评估结果说明所有模建PT蛋白结构的准确性都是可以接受的。分析显示所有亚型催化腔中大部分的围腔位点是一致

7、的，是区域性的围腔位点突变产生了不同朝向的指形区。在不同亚型中，催化腔形状和体积、催化对位置等因素与环化区域选择性和化合物大小相对应。在PT结构域序列中，由保守氨基酸残基负责环化功能，而关键氨基酸残基的进化，改变了PT催化腔的大小和形状，从而导致环化功能的分化。以上研究阐明了真菌聚酮合酶PT结构域的序列、结构和功能之间的关系，能够更好的理解PT结构域的环化机制，指导通过非还原型聚酮合酶序列预测化合物结构类型，并帮助指导真菌聚酮合酶的组合

8、生物合成操作，调控生合成途径获得目标代谢产物。
　　M311B聚酮合酶结构域序列、结构与功能预测
　　在上述研究结果的基础上，对获得的M311B聚酮合酶进行功能分析。识别8条聚酮合酶结构域组成，其中非还原型聚酮合酶PksA和PksI中SAT和PT结构域，为首次对链格孢聚酮合酶SAT和PT结构域的研究报道。通过PT结构域的研究，推测M311B非还原型聚酮合酶PksA很可能通过C2-C7环化方式，合成化合物1，3，6，8-四羟基